Métodos L.A.M.P.
Amplificación isoterma mediada por LOOP
Guía
Este protocolo ha sido elaborado durante el desarrollo del Proyecto de Innovación, “Amplificación isotérmica mediada por LOOP (LAMP) de ácidos nucleicos. Un nuevo reto en las técnicas analíticas biotecnológicas”,en el I.E.S Juan Carlos I y coordinado por José María Espinosa Bernal. La financiación corrió a cargo del Centro de Profesores y Recursos, C.P.R. de la Consejería de Educación y Cultura de Murcia.
Introducción
LAMP es una técnica de amplificación de ácidos nucleicos isotérmica. A diferencia de la tecnología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en la que la reacción se lleva a cabo alternando una serie de pasos o ciclos de temperatura, la amplificación isotérmica se lleva a cabo a una temperatura constante y no requiere un termociclador .
Necesita de, al menos, cuatro cebadores, pero puede llegar a utilizar seis; 2 cebadores externos F3 y B3, 2 cebadores internos FIP (F1C, F2) y BIP (B1C, B2) que tienen secuencias tanto sentido y antisentido de tal manera que ayuda en la formación de un bucle y 2 cebadores bucle F(FLP) y B(BLP) diseñados para acelerar el reacción de amplificación mediante la unión adicional a sitios que no son accesibles por los cebadores internos. Reconociendo un total de 8 secuencias distintas del DNA blanco (Figura N°1) todos estos cebadores son los que le dan la especificidad al método.
La ADN polimerasa que se utiliza es la Bst polimerasa, la cual tiene actividad desplazante de cadena, y proviene de Bacillus stearo-thermofilus. La forma en la que se amplifica este ADN es compleja de explicar, aunque podemos encontrar un buen resumen en el siguiente vídeo donde podemos comprobar que se producen una serie de fragmentos de longitud variable, lo que en principio no nos valdría para identificar el amplicón con una electroforesis, ya que nos saldrán una serie de bandas indiscriminadas, pero en realidad, el hecho de que se produzca esta distribución, nos puede servir como prueba positiva.
Una vez amplificado el ADN, podremos detectarlo por vários métodos: turbidez, fluorescencia o por electroforesis. En el caso de la fluorescencia, y con el reactivo que vamos a utilizar, la propia master mix (WarmStart® Colorimetric LAMP 2X Master Mix) contiene el agente de detección. Una resultado positivo aparece de color amarillo.
Si optamos por una electroforesis, como hemos comentado anteriormente, al generarse un conjunto de estructuras de difentes tamaños, este sería el resultado, donde las calles 1-3 son controles negativos y las calles 4 a 6 son positivos. A diferencia de la PCR, no podemos relacionar una banda concreta con nuestros patrones, pero esa distribución es ya indicativa de que se ha producido, efectivamente, una amplificación por Loop.
Protocolos
Todos los protocolos que estamos utilizando, así como los resultados que estamos obteniendo, los puedes seguir en el documento de Google compartido al que pudes acceder con este enlace. Si deseas comentar algún apartado, consultar algún aspecto, etc, lo puedes hacer como un comentario en ese documento.